COVID-19 Y PCR. ¿PUEDE CONFUNDIRSE CON EL CROMOSOMA 8 DEL GENOMA HUMANO?

En algunas de mis conferencias sobre prevención del cáncer recurro a la siguiente pregunta, si lanzamos una moneda al aire, ¿Cuál es la probabilidad de que salga cara o cruz? Lógicamente la gente suele contestar que igual posibilidad. Lógicamente es así pero también lo es que no. Me explico, se han hecho experimentos donde podemos “manipular” el experimento de tal forma que balancee el sentido de la probabilidad a que salgan, por ejemplo, más caras que cruz.

En mi último post cuando os hablaba de que es lo que causaba la enfermedad COVID-19, mencionaba que para no herir susceptibilidades era más adecuado hablar de probabilidades. En concreto argumenté las distintas probabilidades de que un agente X sea causa de un evento Y.

Un documento aprecia que uno de los cebadores empleados de una longitud de 18 letras coincide con una secuencia situada en alguna parte del cromosoma 8 del ser humano.

Me viene muy bien hacer esta introducción ya que ha comenzado a correr como la pólvora en redes sociales una noticia “explosiva” por la cual la famosa prueba PCR puede dar positivo a cualquier persona ya que no es capaz de diferenciar entre el coronavirus y el cromosoma 8 del genoma humano.

Como bioquímico y biólogo molecular voy a argumentar mi punto de vista sobre esta noticia. Por tratarse de un tema sumamente complejo, lo intentaré razonar de la forma más didáctica posible.

Iré por partes.

¿Qué es la PCR?

En ocasiones, tengo la triste impresión de que se intenta denigrar la PCR. Esta técnica, reconocida como uno de los avances científicos más importantes del siglo XX, fue inventada por Kary Mullis (muy mencionado últimamente) La PCR se utiliza en muchas áreas de la biología y la medicina, para poder determinar secuencias concretas de genomas (material genético)

Conflicto RT-PCR versus SARS-CoV-2

En el caso concreto del coronavirus, la PCR es aceptada por la comunidad científica internacional como Gold Standard en la detección del SARS-CoV-2. Si bien su propósito es muy loable, detectar el virus en muestras de aguas residuales, pero principalmente en muestras humanas, como también ocurre con otras pruebas diagnósticas, ésta no es infalible y tiene también debilidades. La principal es que la positividad de esta prueba, indica presencia de material genético, pero no garantiza la viabilidad del virus, es decir, su posible infectividad. Este aspecto, por ejemplo, en el caso de un asintomático es un problema que puede llevar a muchos conflictos sociales.

En este contexto, una noticia de estas características, podría ser aprovechada para desacreditar aún más esta técnica, especialmente por parte de ciertas personas muy críticas con la pandemia.

El código genético del coronavirus tiene una longitud de aproximadamente 30.000 letras

Fundamentos básicos (con un propósito didáctico de la RT-PCR

Para entender bien el fondo del problema, antes hemos de explicar de forma muy sintética, en que consiste la prueba.

El código genético del coronavirus tiene una longitud (expresada en letras) de aproximadamente 30.000 letras. Hablamos así de una determinada secuencia, es decir, de un orden determinado y distribuido por zonas, de una serie de cuatro letras, A, C, G y U que se repiten a lo largo de toda la secuencia.

Como la PCR solo funciona con material genético en forma de ADN (doble hebra) y el coronavirus tiene un material genético en forma de ARN (hebra simple), se hace necesario una enzima, la transcriptasa inversa que se encarga de un proceso de retrotranscripción, es decir, sintetizar ADN de doble cadena utilizando como molde el ARN monocatenario, original del virus. De ahí el nombre de la prueba, RT-PCR. 

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio cuyo objetivo principal es hacer cantidades ingentes de copias de una región particular y relativamente corta de material genético (alrededor de 200 letras). La técnica de PCR se puede emplear para muchos fines, tan loables como, por ejemplo, determinar un marcador genético usado por científicos forenses para relacionar el ADN de la escena del crimen con los sospechosos o para aislar un gen cuya función queremos comprender. En este caso, el objetivo es determinar la presencia o ausencia de material genético de SARS-CoV-2, con fines que cualquier lector de buena fe, comprenderá.

¿Qué es un cebador?

Para que la prueba se desarrolle se hace necesario la presencia de un cebador. Es decir, como el objetivo de la prueba es producir suficiente código genético de la región blanco (200 letras) para que pueda analizarse, las ADN polimerasas que empleamos solo pueden funcionar si hay un primer o un cebador. Este es una corta secuencia de nucleótidos (suelen ser de 18-20 nucleótidos) que proporciona un punto de partida para la síntesis de ADN que deseamos determinar.

¿Dónde está el problema?

En una reacción de PCR, la región de ADN que será copiada, o amplificada, se determina inicialmente por los cebadores que él o la investigadora elija.

El problema radica en que ha salido un documento en el que se aprecia que uno de los cebadores empleados de una longitud de 18 letras coincide con una secuencia situada en alguna parte del cromosoma 8 del ser humano.

Siendo así, se podría pensar entonces que la PCR en vez de detectar secuencias del coronavirus, podría “leer” en realidad parte de un cromosoma humano y desacreditar así la positividad de la prueba. Consultar referencias aquí y aquí

Como esta secuencia “CTCCCTTTGTTGTGTTGT” de 18 caracteres se encuentra en el documento de protocolo de prueba de PCR de coronavirus de la OMS, ello pudiera dar lugar a múltiples interpretaciones. Lo dejaré aquí.

¿Una RT-PCR diseñada para SARS-CoV-2 podría dar positivo “confundida” por el cromosoma 8 del ser humano?

La respuesta es que sería muy improbable que esto ocurriera. Evidentemente, este problema se debería llevar al campo experimental; así es como deben de funcionar las cosas. A falta de ello, por mi parte, solo argumentaré, bajo mi punto de vista, esta mínima probabilidad, desde el sentido común.

1. Muy importante. Las marcas fluorescentes por lo general no detectan cebadores, sino secuencias específicas del ADN retrotranscrito del virus que emiten fluorescencia (usando previamente otros marcadores). Así, a mayor fluorescencia en la muestra, mayor cantidad de copias del ADN obtenido mediante la retrotranscripción del virus SARS-CoV-2. Se aprecia con las curvas obtenidas. Una curva sigmoide indicará positividad y la observación de una línea recta, indicará negatividad.

2. Realmente se hace una PCR cuantitativa. Esta variante permite medir en tiempo real la cantidad de fragmentos de ADN que se van produciendo (mediante este marcado fluorescente). Este es un punto capital, ya que, a mayor número de copias realizadas, procedentes del material genético que haya podido seleccionar la técnica, en mayor medida podrán ser detectados.

Digo que este es un punto capital ya que lo que va a definir el objetivo de fino diagnóstico de la muestra obtenida va a ser la capacidad de detección. Y esta es una cuestión también de probabilidades.

1. En una célula infectada, ¿Cuántas copias de SARS-CoV-2 hay conteniendo la secuencia a analizar? Respuesta estimativa, entre 10.000 y 100.000. Y en una misma célula, ¿Cuántas copias del cromosoma 8 hay? Respuesta contundente: 1. La amplificación por parte de la PCR de cada una de estas secuencias quedará probabilísticamente muy pero que muy balanceada del lado del coronavirus y residualmente del lado del cromosoma 8 por lo que el marcado fluorescente detectará lo que más haya: virus. El resto será muy residual y probablemente indetectable. Las curvas antes mencionadas serían testigos de ello.

2. ¿Cuántos cebadores se emplean (elegidos por el investigador) por secuencia analizada? Dos. En cada reacción de PCR se utilizan dos cebadores que están diseñados para flanquear la región blanco (la región que debe ser copiada). Uno por un extremo de la cadena (5´-3´) y otro por el extremo contrario de la cadena (3´-5´) Recordad que son cebadores específicos de la secuencia de aproximadamente 200 letras del virus que quiero detectar. La ADN polimerasa al tener dos cebadores irá más rápido en el caso de encontrar la secuencia del virus y al acabar de “leer”, la DNA polimerasa se soltará. Obtendremos una doble cadena, objeto de amplificación. Sin embargo, en el hipotético caso que la polimerasa encontrase un solo fragmento del cromosoma 8 (al emplear un cebador compatible) también comenzará a leer. Pero dos consideraciones. La primera es que irá más lento ya que NO EXISTE otro cebador que lea específicamente el otro lado de la cadena. La segunda, es que no podrá crear una doble cadena (al carecer de la especificidad de ese segundo cebador)

3. Y en la creación de estas dobles cadenas (en el caso del coronavirus) y cadenas simples (en el caso del cromosoma 8) hay otro matiz fundamental. El mismo mecanismo de la técnica rige por lo que me permito denominar regla “2n”, es decir, la RT-PCR establece ciclos de copias donde en cada una de ellas se duplican las cantidades: de dos copias, se pasan a cuatro; de cuatro, a ocho, y así sucesivamente. En un sistema habitual de RT-PCR en tiempo real suele constar de 35 ciclos. A medida que se producen nuevas copias de las partes del ADN vírico, los marcadores se acoplan a las cadenas de ADN y emiten una fluorescencia, que el ordenador del aparato medirá y visualizaremos en tiempo real, aspecto que podremos monitorizar. Entonces, si partimos de una doble cadena (detectado el coronavirus) probabilísticamente tendré muchas más copias que si partimos de una sola cadena (detectado el cromosoma 8)

En base a esto, me atrevería a establecer la siguiente conjetura. Habría una posibilidad de que la PCR detectara un fragmento del cromosoma 8 en vez de fragmentos del coronavirus, como la posibilidad de que en una pared donde hay una cantidad considerable de globos, la práctica totalidad de globos rojos y muy escasos amarillos, al tirar un dardo a ciegas, pinchamos el globo amarillo.

3. Una buena RT-PCR que quiera detectar de forma muy específica el SARS-CoV-2, además seleccionaría no una, sino tres regiones distintas del RNA del coronavirus, con sus respectivos cebadores, de tal forma que la secuencia que componen estas 200 letras, no se puedan encontrar en otros organismos. En base a ello, también me atrevería a conjeturar que mediante este procedimiento tendríamos similar probabilidad de detectar un falso positivo (cromosoma 8) como que, en una pared de 1000 globos, 998 rojos y 2 amarillos, con los ojos cerrados, pinchase un globo amarillo.

Parece ser que los científicos chinos y también los americanos, tuvieron al principio muchos problemas con la adecuada puesta a punto de la prueba. Parece ser que algunos laboratorios ya no emplean este cebador.

Recurriendo a la tira de una moneda del inicio del post, podría ocurrir que, con toda esta información, un trilero quisiera jugar sucio y quisiera forzar que se pinchase el globo amarillo. ¿Ha sido una “casualidad” o una “causalidad” utilizar un cebador de secuencia “CTCCCTTTGTTGTGTTGT”? Yo tengo claro lo primero, pero como todo es posible en la viña del señor, este tema lo dejaré para otros.

Gracias por leerme.

Acerca del Autor

Licenciado en Ciencias Biológicas, especializado en Bioquímica y Biología Molecular por la Universidad de Valencia. Inició su carrera como Analista en el Instituto Valenciano de Oncología (IVO) y en la actualidad es Responsable Técnico-Formativo y Responsable de Proyectos de Dietéticos Intersa. Autor de diversos libros. Divulgador científico sobre temas de Medicina y Oncología Integrativa. Miembro fundador de la Sociedad Española de Salud y Medicina Integrativa (SESMI). Socio numerario-fundador de la Sociedad Española de Fitoterapia (SEFIT).